人类皮肤来源前体细胞的表型和特征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.018

中国组织工程研究

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

人类皮肤来源前体细胞的表型和特征

刘桂英1，杨立业2，3，李文玉2，郑佳坤3

潮州市中心医院，¹口腔科，²检验中心，³神经外科，广东省潮州市 521021

收稿日期:2012-10-11 修回日期:2012-12-12 出版日期:2013-09-03 发布日期:2013-09-03
通讯作者: 杨立业，主任医师，潮州市中心医院检验中心，神经外科，广东省潮州市 521021 yangleeyee@sina.com
作者简介:刘桂英★，女，1970年生，辽宁省清原县人，满族，硕士，主要从事干细胞的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(30672359)*

Phenotypes and characteristics of human skin-derived precursors

Liu Gui-ying¹, Yang Li-ye^{2, 3}, Li Wen-yu², Zheng Jia-kun³

¹Department of Stomatology, ²Laboratory Medicine Center, ³Department of Neurosurgery, Chaozhou Central Hospital, Chaozhou 521021, Guangdong Province, China

Received:2012-10-11 Revised:2012-12-12 Online:2013-09-03 Published:2013-09-03
Contact: Yang Li-ye, Chief physician, Laboratory Medicine Center, Chaozhou Central Hospital, Chaozhou 521021, Guangdong Province, China; Department of Neurosurgery, Chaozhou Central Hospital, Chaozhou 521021, Guangdong Province, China yangleeyee@sina.com
About author:Liu Gui-ying★, Master, Department of Stomatology, Chaozhou Central Hospital, Chaozhou 521021, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30672359*

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究证实，从人类的皮肤中成功分离出皮肤源性前体细胞并在体外长期培养，可分化为神经元、胶质细胞、平滑肌细胞以及具有周围神经元表型的细胞和许旺细胞。
目的：进一步证实人皮肤组织来源的多能干细胞的培养方法和多方向分化能力，尤其向神经细胞、成骨细胞分化的可能性。
方法：采用胰蛋白酶消化法培养人皮肤组织来源的前体细胞，应用免疫细胞化学的方法对细胞进行鉴定。取三四代的细胞分别进行神经元诱导分化、成骨细胞诱导分化、von Kossa法钙染色、软骨细胞诱导分化、甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色及苏丹黑染色。观察皮肤来源的前体细胞巢蛋白、波形蛋白、βⅢ管蛋白、S100及Ⅱ型胶原的表达。
结果与结论：用胰蛋白酶消化法培养出人皮肤组织来源的前体细胞，增殖聚集能够形成悬浮的细胞球，在培养的不同时间都可检测到巢蛋白阳性的细胞。培养的全部细胞表达波形蛋白，在贴壁的细胞中也能检测到βⅢ管蛋白的表达。利用丹参诱导皮肤源性前体细胞向神经元样细胞分化，表达神经细胞的标志物。应用成骨细胞诱导，von Kossa 染色发现培养皿中有黑色的钙化结节产生，说明皮肤源性前体细胞能够分化为成骨细胞；将皮肤源性前体细胞向软骨细胞诱导，甲苯胺蓝染色强阳性，部分细胞表达Ⅱ型胶原，证明分化的细胞中含有软骨细胞。实验结果证实，皮肤中存在的多能干细胞能够分化为成骨细胞、软骨细胞、许旺细胞和少突胶质细胞。

关键词: 皮肤, 多能干细胞, 表型, 神经元, 成骨细胞, 软骨细胞, 许旺细胞, 胶原Ⅱ型

Abstract:

BACKGROUND: Human skin-derived precursors can be cultured for a long term in vitro, and differentiated into neurons, glial cells, smooth muscle cells, Schwann cells and cells with peripheral neurons phenotype.
OBJECTIVE: To investigate the culture conditions and multiple differentiation capacity of multipotential stem cells from human skin, especially the potentials of differentiating into neurons and osteoblasts.
METHODS: Human skin-derived precursor cells were cultured with trypsin digestion method, and identified with immunocytochemistry. Cells at passages 3-4 were induced to differentiate into neurons and osteoblasts, and underwent von Kossa staining protocol for calcium, chondrocyte induction, toluidine blue staining, immunohistochemical staining and Sudan black staining. The expression of nestin, vimentin, βIII-tubulin, S100 and collagen II in the human skin-derived precursors was detected.
RESULTS AND CONCLUSION: The human skin-derived precursor cells cultured with trypsin digestion method could proliferate and form suspending spheres, and nestin positive cells were detected at any time point of the culture. All the cultured cells expressed vimentin, and some adherent cells expressed βIII-tubulin. Human skin-derived precursor cells were induced with Salvia miltiorrhiza to differentiate into neuron-like cells, and expressed marker of nerve cells. Skin-derived precursors could be induced to differentiate into osteoblasts and von Kossa staining displayed black calcified nodules in the culture dish. Skin-derived precursors could also be induced to differentiate into chondrocytes, and toluidine blue staining was strongly positive, and some cells expressed collagen II, which suggested that, the differentiated cells contained chondrocytes. Experimental findings indicate that, skin contains multipotential stem cells that are capable of differentiating into osteoblasts, chondrocytes, Schwann cells and oligodendrocytes.

Key words: skin, multipotent stem cells, phenotype, neurons, osteoblasts, chondrocytes, Schwann cells, collagen type Ⅱ

中图分类号:

R394.2

刘桂英，杨立业，李文玉，郑佳坤. 人类皮肤来源前体细胞的表型和特征[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.018 .

Liu Gui-ying, Yang Li-ye, Li Wen-yu, Zheng Jia-kun. Phenotypes and characteristics of human skin-derived precursors[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.018 .

图/表（结果） 4

2.1 皮肤源性前体细胞的原代培养结果 见图1。胰蛋白酶消化后分离的单细胞见图1A，原代培养 24 h后见少量的细胞存活，4-7d培养皿中出现悬浮生长的细胞球见图1B，10-14 d将悬浮培养的细胞分离成小的细胞球，传至新的培养皿中加入培养基培养，经6- 10 d的培养后，又形成新的细胞球，有部分细胞贴壁。经四五次传代，细胞的形态较均一，但再次传代时仍有细胞贴壁，细胞的生长呈半悬浮状态，悬浮状态或贴壁状态。传代的细胞在含有体积分数10% FBS的培养基中培养，也可以增殖，但细胞的形态发生变化，表现为悬浮的细胞贴壁，胞体增大，长度增加，见图1C。实验观察不同年龄人的细胞培养条件，从7岁到21岁的皮肤中均可培养出这种细胞(n=6)。皮肤源性前体细胞在体外至少可维持2个月左右的增殖状态，传代10次左右。

2.2 皮肤源性前体细胞分化细胞的鉴定结果 见图2。稳定培养和传代的细胞植在培养皿中进行免疫细胞化学检查，在培养的不同时间都可检测到巢蛋白阳性的细胞，阳性细胞可以为类似神经细胞形态或成纤维细胞形态，见图2A，B；细胞球中的大部分细胞也表达巢蛋白，见图2C。在贴壁的细胞中也能检测到βⅢ管蛋白的表达，阳性部位为胞浆，阳性细胞的形态多样，以成纤维细胞样为主，见图2D。阴性对照的细胞中未见阳性表达，见图2E。培养的全部细胞表达波形蛋白。检测的第3-5代的细胞都能检测到α-平滑肌肌动蛋白的表达，阳性的细胞形态扁平，有的细胞能识别出平行的肌丝样结构，见图2F。因此，作者认为这种细胞为平滑肌细胞。原代培养和传代培养的细胞均可见含有脂滴的细胞，苏丹黑B染色为黑色，细胞中出现脂滴是脂肪细胞的特征，因此皮肤源性前体细胞分化的细胞中有脂肪细胞，见图2G，H。这种脂肪细胞的比例在不同的个体和传代次数的比例不同，在1%-10%。培养的细胞中未发现胶质纤维酸性蛋白的表达，说明无星形胶质细胞的形成。

2.3 皮肤源性前体细胞向神经细胞分化结果 见图3。在传代培养的细胞中(n=4/6)，能够发现培养皿中集落样生长的细长的细胞，与大部分细胞的形态完全不同。细胞呈梭形，核椭圆，细胞体较小，胞体两端有两个丝状突起，形态类似许旺细胞，另一些细胞扁形，圆核，多突起的为成纤维细胞，见图3A。为了证明许旺细胞的存在，检测发现这种梭形细胞表达S100，见图3B，形态学和免疫组织化学证明这种梭形细胞是许旺细胞。同时发现S100阳性的多角形的细胞，深入地研究发现这种细胞也表达髓鞘基础蛋白和半乳糖脑苷脂(见图3C，D)。这种细胞表达的标志物与中枢神经系统的少突胶质细胞相同，但形态与少突胶质细胞不完全相同。

皮肤源性前体细胞培养在含血清的培养基中细胞的形态发生变化，表现为胞体增大，长度增加，见图3E。细胞达到60%-70%融合时吸出含有血清的培养基，加入碱性成纤维细胞生长因子预诱导24 h，然后利用丹参注射液诱导细胞向神经元样细胞分化，细胞的形态变化与骨髓基质细胞类似，诱导4 h以内大部分细胞的形态发生变化，表现为胞体收缩，发出两三个突起，类似神经元的形态，但与中枢神经系统来源的神经元有明显不同，发出的突起没有真正的神经元那样纤细，没有侧突，见图3F。

2.4 皮肤源性前体细胞分化为成骨细胞和软骨细胞结果 见图4。

未经诱导的细胞von Kossa染色无钙结节产生；而应用成骨细胞诱导三四周，von Kossa 染色发现培养皿中有黑色的钙化结节产生，说明皮肤源性前体细胞能够分化为成骨细胞，见图4A。

未经过诱导的细胞免疫化学检查无Ⅱ型胶原和MyoD的表达，说明无软骨细胞和成肌细胞的产生。应用Micromass方法将皮肤源性前体细胞向软骨细胞诱导3周，甲苯胺蓝染色强阳性，见图4B；部分细胞表达Ⅱ型胶原，见图4C。因此分化的细胞中含有软骨细胞。软骨细胞的比例与传代次数有关，变化范围较大，由于细胞重叠，精确计数困难，估算分化的软骨细胞比例在10%-30%之间。

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引言

组织修复的一个基本问题是细胞来源问题，目前用于骨和软骨组织修复的主要种子细胞为骨髓基质细胞，也有应用脂肪组织来源的干细胞，这两种细胞都具有多种方向的分化能力，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、神经细胞和脂肪细胞^[1-2]。分化的脂肪细胞可以用于乳房的整形，分化的神经细胞能够用于神经组织的修复。皮肤组织来源于外胚层，中枢神经系统也来源于外胚层，因此从发育的角度来看，皮肤组织中含有神经分化的细胞是可能的。加拿大的一个研究小组从小鼠皮肤组织中培养出干细胞，命名为皮肤源性前体细胞，这种细胞可以分化为平滑肌细胞、胶质细胞和脂肪细胞，小鼠皮肤源性前体细胞能够分化为神经元，并且表达神经元的标志物，由此确定这种细胞为多能干细胞^[3]。

从小鼠和人类皮肤中培养的皮肤源性前体细胞的性质与骨髓基质细胞不同，皮肤源性前体细胞能分化至少两个胚层的细胞，包括神经元、胶质细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞和成骨细胞，实际上可能还不仅仅是这几种细胞，向其他未知细胞的分化目前还在研究之中^[3-4]。

作者对小鼠皮肤组织的研究中也发现了这种多潜能分化的干细胞，能够分化为神经元样细胞、胶质细胞和脂肪细胞^[5]。目前国外从人类的皮肤中成功分离出皮肤源性前体细胞并在体外长期培养，可分化为神经元、胶质细胞、平滑肌细胞以及具有周围神经元表型的细胞和许旺细胞^[4]。现在作者尝试从人类皮肤组织中分离培养多潜能的干细胞，明确其在体外的多方向分化能力，尤其向神经细胞、成骨细胞分化的可行性，为组织工程研究和神经移植探寻一种新的细胞来源。

材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2006年4月至2008年4月在潮州市中心医院中心实验室完成。

材料：

观察皮肤源性前体细胞表型实验所需的试剂：

实验方法：

皮肤源性前体细胞培养：皮肤组织来源于 7-21岁男性包皮环切术后的包皮组织，组织的获取得到潮州市中心医院伦理委员会的批准和患者或家属的同意。人类皮肤组织的多能干细胞的培养方法与小鼠基本相同^[3-4]：用体积分数75%的乙醇浸泡消毒除菌10 min，PBS洗3次，无菌条件下将组织剪碎，Hanks缓冲液冲洗3次，1 g/L的胰蛋白酶37 ℃消化40-50 min，加入含有体积分数10% FBS的培养基终止消化，移至离心管中配平后1 500 r/min离心(离心半径15 cm)去上清，筛网过滤去除大的组织块，Hanks缓冲液洗2次，离心，沉淀中加入含有体积分数10% FBS的培养基，用吸管反复吹打(30-40次)组织块使细胞分离，通过孔径为40 μmol/L的筛网过滤，收集的细胞离心去上清，培养基重悬细胞，种植在培养瓶中培养。培养基的成分为DMEM/F12 (1∶1)加入2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL的青霉素、100 mg/L的链霉素、B27添加剂(1∶50)、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和20 μg/L表皮生长因子。细胞的种植浓度约为8×10⁶ L^-¹，每隔5-7 d传代1次，传代时将悬浮的细胞离心后继续培养，贴壁的细胞用2.5 g/L的胰蛋白酶/EDTA混合液37 ℃消化、离心、加入新的培养基。细胞稀释两三倍传至培养瓶或培养皿中培养，两三天换半量培养液。

向神经元诱导分化：诱导方案与参考文献[6]完全相同。将三四代的细胞消化传至3.5 cm的培养皿中，应用DMEM/F12/10%FBS培养，待细胞生长至60%-70% 融合时进行神经元诱导。加入诱导分化的培养基，即DMEM/10%FBS/20 ng碱性成纤维细胞生长因子，24 h后，吸去培养基，PBS洗2次，换成DMEM/0.5%丹参注射液(体积比)，处理1-5 h，吸去培养基，换成N2培养基/10 ng碱性成纤维细胞生长因子，N2培养基的组成为DMEM/F12(DMEM∶F12为1∶1)和N2添加剂。对照组中的细胞培养和预诱导的条件与实验组相同，仅在用丹参诱导分化的步骤改为DMEM培养基，细胞的后期处理与实验组相同。在不同的时间点将细胞固定进行免疫细胞化学检查。

向成骨细胞诱导分化：诱导分化的方法同参考文献^[2^，^7-8]，细胞(三四代)种植在3.5 cm培养皿中，待细胞达到40%-50% 融合时，加入诱导分化的培养基，即含有体积分数1%胎牛血清的DMEM中加入终浓度为 0.1 μmol/L地塞米松，50 μmol/L抗坏血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸钠，诱导分化三四周。

von Kossa法钙染色：将培养的细胞在多聚甲醛中固定后，加入5%硝酸银，避光、室温孵育30 min，用三馏蒸水洗涤细胞后，在紫外光下放置30 min，用伊红复染30 s，检测钙结节的形成。

向软骨细胞诱导分化：采用第三四代的细胞，应用Micromass方法向软骨细胞诱导，具体方法见参考文献[2，8]。首先贴壁培养的细胞用2.5 g/L的胰蛋白酶/ EDTA 37 ℃消化5 min，吸管吹打使细胞脱壁，加入含10%FBS的DMEM培养基终止消化。细胞悬液置入离心管1 000×g离心10 min，弃上清，沉淀细胞组织中加入培养基，将细胞浓度调节为(4-8)×10⁸L^-¹，将细胞滴入6 cm培养皿中，每个培养皿中滴入五六滴，每滴之间不能接触，间隔4 mm以上。放入培养箱中培养4 h，这时细胞基本贴壁。再加入足量培养基进行培养，培养基的成份为：基础培养基是DMEM/体积分数1% FBS，含有6.25 mg/L胰岛素、10 μg/L转化生长因子β1和50 nmol/L的抗坏血酸^[4]。每6 d换半量培养基。体外培养3周细胞固定，分别进行甲苯胺蓝染色和免疫组织化学检查Ⅱ型胶原的表达。甲苯胺蓝染色步骤：细胞固定后甲苯胺蓝染色90 s，醋酸洗掉浮色，倒置显微镜观察，拍照。

免疫细胞化学检查：在培养皿上的细胞直接进行免疫细胞化学检查。倒掉培养基，用PBS洗去培养液，40 g/L的多聚甲醛固定15 min后倒掉，PBS洗3次，5 min/次；0.2%的TritonX-100处理15 min后倒掉，PBS洗3次，5 min/次；体积分数3% H₂O₂孵育10 min，蒸馏水洗3次，5 min/次；滴加试剂1(体积分数5%正常山羊血清)封闭15 min，弃去封闭液，不洗；加入适当比例稀释的第一抗体，置湿盒中4 ℃过夜，PBS洗3次，3 min/次；滴加试剂2即二抗(生物素化山羊抗小鼠/兔IgG)，37 ℃反应15 min，PBS洗3次，3 min/次；滴加试剂3(链霉卵白素工作液)，37 ℃反应15 min，PBS洗3次，5 min/次；AEC显色：取1 mL蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至培养皿中，室温反应5-10 min。显微镜下观察、照相。实验重复3次以上。设置阴性对照：用0.01 mol/L的PBS代替一抗。

苏丹黑染色：培养皿中出现含脂滴的细胞，用40 g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定15 min，然后用10 g/L苏丹黑乙醇液染色5 min，体积分数75%乙醇去除多余的染液，显微镜观察。

主要观察指标：①皮肤源性前体细胞的原代培养及鉴定结果。②皮肤源性前体细胞向神经细胞分化、向成骨细胞分化和向软骨细胞分化结果。

讨论

毛囊中含有的干细胞在体外培养的条件下能够分化为神经元和胶质细胞^[9-10]。作者采用的是包皮组织，不含有毛囊，因此获得的神经细胞可能来源于其他结构。从发育的角度来说，神经组织和皮肤组织都来源于外胚层，皮肤组织中含有神经组织是可能的。加拿大的一个研究小组从小鼠和人的皮肤组织中培养出干细胞，命名为皮肤源性前体细胞，培养条件与神经干细胞的培养条件相似。这种细胞也可以分化为平滑肌细胞、胶质细胞和脂肪细胞，皮肤源性前体细胞也能够分化为神经元，并且表达神经元的标志物，由此确定这种细胞为多能干细胞^[3-4]。

皮肤源性前体细胞也与以往的其他成年体内的干细胞不同，如神经干细胞倾向于向神经细胞分化；骨髓基质细胞一般只向中胚层细胞分化，只有在特殊的诱导条件下才可以分化为神经细胞^[1^，^6]；造血干细胞只分化为血细胞。而皮肤源性前体细胞显然代表了一种新的多能干细胞，它的向某一特定方向分化的倾向不明显，这种来源于皮肤的能够长期培养和传代的细胞对于自体的细胞移植有一定的临床意义。

皮肤源性前体细胞在0.1 μmol/L地塞米松，50 μmol/L抗坏血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸钠的诱导下，能够分化为成骨细胞，培养皿中钙化结节就是证明。皮肤源性前体细胞在体外可以分化为成骨细胞和软骨细胞，这在Toma的研究中是没有报告的^[3-4]。这对于自体骨移植有一定的临床应用价值，可以从骨缺损患者的皮肤中获得皮肤源性前体细胞，在体外大量培养，将细胞吸附到支架上，再移植到同一个患者的骨缺损部位，这样可以避免免疫排斥的发生。

目前在组织工程常用的种子细胞是骨髓基质细胞和脂肪组织来源的干细胞^[1^，²^，^6-7^，^12]。而皮肤中存在的能够分化为成骨细胞和软骨细胞的多能干细胞，其优点与骨髓基质细胞相比，皮肤源性前体细胞的来源更加方便，骨髓基质细胞的获得需要骨穿和局部麻醉，患者要承受一定的痛苦，而皮肤的来源则相对容易。实验建立

起皮肤源性前体细胞向成骨细胞分化的技术平台，为组织工程骨的研究开发了一种新的细胞来源，为其最终走向临床创造了条件。

作者的研究对临床的细胞治疗也有一定的应用意义，细胞替代疗法在中枢神经系统疾病的治疗已获得一定的疗效，但也存在一定的问题。目前临床应用的是人类的胚胎组织进行移植，将来也可应用胚胎干细胞分化来的神经细胞移植，但这两种方案都存在伦理问题的争议，而且应用胚胎组织移植属于异体移植^[13]。国外有研究将分离扩增的小鼠皮肤源性前体细胞及其分化的许旺细胞移植到受损的脊髓部位，发现这两种细胞都能在损伤部位存活，使挫伤的腔隙缩小，使内源性的宿主轴突髓鞘再生，动员内源性的许旺细胞移行到损伤的脊髓部位，更重要的是皮肤源性前体细胞来源的许旺细胞能够增强肢体的运动功能，对机械的和热的敏感域没有影响^[14-15]。

皮肤源性前体细胞可以在体外分化为许旺细胞和少突胶质细胞，对治疗中枢神经系统疾病有潜在的应用价值^[14-16]。与其他的干细胞相比有显著的优越性：皮肤源性前体细胞容易获得；在体外增殖速度快；能够进行自体移植，可以克服免疫障碍。因此皮肤源性前体细胞可以做为一种潜在的自体神经移植的新细胞来源。

人类皮肤源性前体细胞在体外随机分化的细胞中仅能偶尔见到神经样细胞，而小鼠的皮肤源性前体细胞就很容易分化为典型的神经元^[3-4，11]。说明在同样的培养条件下，人类的皮肤源性前体细胞和小鼠皮肤源性前体细胞不完全相同。虽然人类皮肤源性前体细胞在丹参的诱导下可以分化为神经元样细胞，但细胞的形态与中枢神经系统的不同，其是否具有神经元的功能还需深入研究。

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